【產品編號】2793951

【英文名稱】5fC CLEVER-seq Kit

【中文名稱】全基因組5-醛基胞嘧啶單細胞檢測試劑盒

【產品內容】

注：溶液P1：丙二腈反應液；M：丙二腈

【保存條件】模式序列置于-20 °C，可保存12個月。

  M和溶液P1置于4 °C，可保存12個月。

M需避光保存。

【產品概述】

5-甲基胞嘧啶修飾（5mC）是真核細胞基因組中最為重要的表觀遺傳修飾之一。5mC可以在TET家族酶的作用下逐步氧化生成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）、5-醛基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC）；對于上述幾種新型DNA修飾的功能研究是目前核酸表觀遺傳學的一個研究熱點。

百靈威推出新型單細胞5fC檢測試劑盒，它主要用于單細胞5-醛基胞嘧啶 (5-formylcytosine, 5fC）的全基因組單堿基分辨率測序；也可應用于5fC在早期胚胎發育和疾病發生發展過程的生物學功能研究。

【自備材料】

• Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)

• NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，＃E7645）

• NEBNext Singleplex or Multiplex Oligos for Illumina (NEB #E7350, #E7335, #E7500, #E7600, #E6609, #E7710, or #E7730)

• MALBAC Single Cell WGA Kit（Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）

• AMPure XP Beads（Beckman Coulter, Inc. #A63881）

• 無水乙醇

• 滅菌超純水

• 低吸附EP、PCR管

• 磁力架

• PCR熱循環儀

• Thermo-mixer (Eppendorf)

【流程概述】

5fC CLEVER-seq Kit 原理圖

【注意事項】

A.    磁珠操作注意事項：

• 應將磁珠孵育至室溫后再使用

• 每次吸取磁珠前都應將其充分混勻

• DNA樣品加入磁珠后應將其充分混勻

• 所有磁珠操作都應于室溫進行

• 移取上清操作應在磁珠被徹底吸附后小心進行

• 磁珠在洗脫之前應充分干燥,避免乙醇殘留影響后續實驗

B.    避免樣品交叉污染

• 吸取不同樣品時更換槍頭

C.  酶的取放應在冰上進行，為避免反復凍融或長期使用后活性下降,我們推薦您在首次使用后將剩余試劑小份分裝凍存。

D. 單細胞避免污染

•單細胞操作微量DNA，在預擴增前，操作需在超凈工作臺中進行，避免污染

•溶液吸取需使用帶濾芯的槍頭

E. 預擴增前所有反應需在一個EP管中進行

【實驗步驟】

起始材料：將分選好的一個單細胞置于MALBAC Single Cell WGA Kit （Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）的Cell Lysis Buffer中。

一. 細胞裂解

按照MALBAC Single Cell WGA Kit（Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）說明書進行細胞裂解。

二. M介導的5fC標記

在裂解的細胞中加入1ul M， 1ul溶液P1和1ul模式序列，充分混勻，置于Thermo-mixer (Eppendorf)中，37°C，850rmp避光反應20h。

三. 單細胞擴增

1. 將標記完成的細胞按照MALBAC Single Cell WGA Kit（Yikon Genomice Co., Ltd Cat.No.YK001A/B）說明書進行單細胞擴增。

2. 擴增完成后，按照Oligo Clean & Concentrator (ZYMO, #D4060)說明書純化上述完成擴增的單細胞。

注：加入30ul 洗脫緩沖液洗脫。

四．文庫構建

按照NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，＃E7645)說明書進行建庫擴增。